SMu0629是AtlA正常生產(chǎn)所必需的。 使用全細胞裂解物的SDS-PAGE和Western印跡分析顯示，SMu0629基因的破壞顯著影響了AtlA的生產(chǎn)和加工。特別是，與UA159相比，629NP和629P突變體中AtlA加工形式的數(shù)量顯著減少，因此atlA轉錄減少可能不是觀察結果的原因。由于AtlA被認為是變形鏈球菌的主要自溶素，我們檢查了突變菌株在44°C的自溶活性。如圖3D所示，629NP和629P突變體都顯示出較低的自溶速率，類似于atlA缺陷突變體。因此，很可能缺乏SMu0629的菌株中AtlA成熟效率降低導致自溶減少，除非SMu0629可以直接參與細胞自溶或影響其他肽聚糖水解酶的活性。
圖3. SMu0629突變體（非極性突變629NP和極性突變629P）的表型特征分析。（A）通過實時熒光定量PCR監(jiān)測atlA基因表達。使用UA159（野生型）、629NP和629P菌株的總RNA，采用630反向引物進行逆轉錄反應測定atlA mRNA。（B）生物膜形成能力。菌株在補充葡萄糖的BM培養(yǎng)基中培養(yǎng)1或2天。數(shù)據(jù)代表至少進行三次重復的兩次獨立實驗。誤差線表示標準差。*表示P<0.01（1天）或P<0.001（2天）（學生t檢驗）。（C）變異鏈球菌野生型（WT）和兩種SMu0629突變體（629NP和629P）的珠磨-SDS煮沸提取物SDS-PAGE分析。經(jīng)SDS-PAGE后，蛋白質分別用考馬斯亮藍染色（上圖）或轉印至硝酸纖維素膜并使用1:350稀釋度的抗630D1多克隆抗血清進行Western blotting（下圖）。M為分子量標準。（D）自溶實驗。菌株自溶活性在Bioscreen C系統(tǒng)中監(jiān)測，該系統(tǒng)設置為每30分鐘檢測前震蕩15秒。細胞懸浮液在AtlA自溶最適溫度（44°C）下培養(yǎng)。黑色線：UA159；灰色線：629NP；灰色虛線：629P。
我們先前證明，AtlA缺陷菌株的缺陷可以通過向atlA突變體培養(yǎng)物中添加少至2 ng ml-1的純化AtlA蛋白來糾正至野生型水平，并且在這些條件下全長蛋白可以加工為79 kDa形式。當將純化的His標簽AtlA蛋白以2.0 ng ml-1的濃度添加到630P和SAB95培養(yǎng)物時，產(chǎn)生正常長度鏈的能力得到恢復，并且缺乏SMu0629的菌株仍然可以將107 kDa形式轉化為AtlA的成熟形式，表明SMu0629可能在分泌或定位過程中對AtlA生物發(fā)生重要，但不直接參與AtlA在細胞表面的加工。此外，盡管SMu0629是AtlA高效表達和加工所必需的，但在測試條件下可能有足夠水平的正確加工AtlA可用以表達評估的表型。
SMu0629基因突變體對氧氣更敏感。 SMu0629功能的一個假設是，憑借其與硫醇-二硫鍵氧化還原酶的序列相似性，它參與變形鏈球菌對氧化環(huán)境的適應，可能通過感知氧化還原狀態(tài)和調節(jié)AtlA的成熟。由于該蛋白家族的某些成員保護細胞對抗氧化應激或參與細胞氧化還原活性，測試了SMu0629基因突變體對氧化應激的反應。用0.2% H2O2處理的H2O2殺傷實驗未顯示指數(shù)生長期中期629NP、629P或親本菌株存活的顯著差異。
圖4. 變形鏈球菌菌株（UA159、629NP和629P）需氧生長的影響。需氧培養(yǎng)采用旋轉搖床（150 rpm）進行。（A）生長曲線。菌株在37°C的BHI培養(yǎng)基中生長，所示數(shù)據(jù)來自三次獨立實驗中具有代表性的一次實驗，且三次實驗結果一致。（B）生物膜形成。菌株在補充有終濃度為20 mM葡萄糖的BM培養(yǎng)基中，通過搖床（150 rpm）進行需氧培養(yǎng)。更多細節(jié)見正文。數(shù)據(jù)代表至少兩次獨立實驗（每次實驗重復三次或以上）的結果。誤差棒表示標準差。*，P < 0.001（學生t檢驗）。
當在通氣條件下生長時，缺乏SMu0629的菌株顯示出顯著較低的生長速率，并且比野生型形成更多聚集體。使用Bioscreen系統(tǒng)獲得的結果通過試管中的生長確認，以確保較低的生長速率不是細胞聚集的假象。此外，SMu0629基因的破壞使生物體在氧氣存在下比野生型菌株形成更多生物膜，類似于atlA突變菌株?？傊覀兊慕Y果表明，當細胞暴露于氧氣時，SMu0629基因突變體和野生型菌株之間存在顯著的表型差異。
VicK傳感器激酶影響SMu0629基因表達和AtlA成熟。 VicRK TCS被研究作為atlA操縱子或AtlA活性的可能調節(jié)系統(tǒng)。變形鏈球菌的Vic系統(tǒng)，對某些相關物種指定為CovRS，最近被顯示調節(jié)葡糖基轉移酶基因（gtfBCD）、果糖基轉移酶基因（ftf）和gbpB的表達，后者編碼葡聚糖結合蛋白B。這些基因產(chǎn)物密切參與外多糖生產(chǎn)，而Gtfs和Gbps尤其對蔗糖依賴性粘附和生物膜形成至關重要。Vic的缺失影響變形鏈球菌生長、蔗糖依賴性粘附、生物膜形成和遺傳能力發(fā)展。在變形鏈球菌UA159的vicK基因中產(chǎn)生缺失突變。vicRKX基因座中的所有三個基因被顯示在一個操縱子中，因此vicK通過非極性插入（vicK-NP）破壞。由于我們無法分離vicR無效突變體，vicK-NP在本研究中用作Vic缺陷菌株。該突變菌株具有改變的生長速率，并在靜態(tài)生長期間在試管底部聚集。突變體形成生物膜的能力在BM-葡萄糖和BM-蔗糖培養(yǎng)基中顯著降低，證實了先前研究中的觀察。
圖5. vicK突變體(vicK-NP)的表型特征分析。(A)通過實時熒光定量PCR檢測SMu0629和atlA基因的表達。使用UA159(野生型)和vicK-NP菌株的總RNA，分別采用629-反義引物和630-反義引物進行逆轉錄。數(shù)據(jù)為三次獨立實驗的平均值±標準差(誤差線)。*表示P<0.05(學生t檢驗)。(B)野生型(WT)與vicK-NP變異鏈球菌菌株兩種不同細胞提取物的SDS-PAGE分析。經(jīng)過SDS-PAGE后，蛋白質采用考馬斯亮藍染色(左圖)或轉印至硝酸纖維素膜進行Western blotting(全細胞裂解液)分析，使用1:350稀釋度的抗630D1多克隆抗血清(右圖)。M泳道為分子量標準。從染色凝膠中切取目標條帶進行質譜分析。(C)自溶實驗。在Bioscreen C系統(tǒng)中監(jiān)測菌株的自溶活性，該系統(tǒng)設置為每30分鐘檢測前震蕩15秒。細胞懸浮液在AtlA自溶活性的最適溫度(44°C)下培養(yǎng)。粗線代表UA159；細灰線代表vicK-NP。
為了研究VicK對atlA操縱子的調節(jié)功能，我們首先比較了vicK突變體和野生型菌株中SMu0629基因和atlA的表達（圖5A）。SMu0629基因的表達在vicK-NP菌株中減少約40%（P < 0.02），atlA的表達減少約35%（P < 0.007）。更重要的是，如使用全細胞裂解物和表面蛋白的4% SDS提取物的SDS-PAGE和Western印跡分析所示，vicK的缺陷導致AtlA（107 kDa）加工為其成熟形式（79 kDa）的幾乎完全抑制（圖5B），并導致對自溶的顯著抗性（圖5C）。
有趣的是，從4% SDS提取部分明顯看出，幾種蛋白質的表達或定位在vicK突變體中顯著受影響。特別值得注意的是，兩個條帶，大約150 kDa和70 kDa，在突變體中比野生型菌株數(shù)量多得多（圖5B）。為了鑒定這兩個條帶，將它們從染色凝膠中切下，并通過基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜分析胰蛋白酶消化模式。較大的條帶被鑒定為GtfC，較小的蛋白質被鑒定為與戈登鏈球菌推定N-乙酰胞壁酰胺酶/溶素和肺炎鏈球菌膽堿結合蛋白D同源的細胞壁蛋白前體蛋白（SMu0555）。因此，這些結果表明Vic系統(tǒng)直接或間接控制毒力因子的定位或表達，包括Gtfs和自溶素。
圖6. 變異鏈球菌菌株（UA159和vicK-NP）需氧生長效應。需氧培養(yǎng)采用旋轉搖床（150 rpm）進行。（A）生物膜形成。菌株在添加20 mM蔗糖的BM培養(yǎng)基中生長，通過結晶紫染色法在聚苯乙烯微孔板上檢測生物膜形成情況。（B）采用實時熒光定量PCR技術檢測需氧生長條件下變異鏈球菌UA159中SMu0629、atlA和vicR基因的差異表達。數(shù)據(jù)顯示為三次及以上獨立重復實驗的平均值±標準差。*表示P<0.02（學生t檢驗）。
氧氣對vicK突變體的影響。 有趣的是，與atlA突變體的情況相似，當細胞在通氣條件下生長時，vicK突變體的長鏈和細胞聚集特征顯著減弱，接近野生型水平。此外，在相同條件下，與野生型相比，vicK突變體在BM-蔗糖培養(yǎng)基中顯示出顯著增加的生物膜形成（圖6A）。盡管vicK突變體的表型受氧氣顯著影響，但vicK基因的表達在氧氣存在或不存在下沒有差異（圖6B）。然而，SMu0629基因（P = 0.05）和atlA（P = 0.003）的表達在氧氣存在下顯著降低（圖6B）。
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