SDS-PAGE和Western印跡。 從在BHI培養(yǎng)基中指數(shù)生長期中期收獲的細(xì)胞沉淀制備變形鏈球菌的蛋白質(zhì)提取物，并用Tris緩沖鹽水洗滌兩次。通過在玻璃珠存在下，在SDS煮沸緩沖液中使用珠磨機(jī)進(jìn)行機(jī)械破碎，如先前描述制備蛋白質(zhì)提取物。也將細(xì)菌細(xì)胞懸浮于4% SDS中，并在室溫下孵育1小時以提取表面相關(guān)蛋白質(zhì)。離心后，上清液用作4% SDS提取物。蛋白質(zhì)通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在含有4.5%堆積膠的10%聚丙烯酰胺凝膠中分離，如Laemmli所述。然后蛋白質(zhì)用考馬斯藍(lán)染色或印跡到Immobilon-P膜上，并進(jìn)行Western印跡分析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。膜與針對全長純化重組AtlA產(chǎn)生的抗-630D1多克隆抗血清一起孵育。通過二辛可寧酸測定確定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。感興趣的條帶從染色凝膠中切下，并送往Donald Danforth植物科學(xué)中心的蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜設(shè)施進(jìn)行鑒定。
轉(zhuǎn)錄分析。 通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR檢查兩個基因共轉(zhuǎn)錄的潛力。通過實(shí)時RT-PCR定量mRNA水平。如先前描述進(jìn)行RNA提取、RT-PCR和實(shí)時RT-PCR，并分析和標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實(shí)時PCR的引物顯示在表1中。
結(jié)果
atlA操縱子。 我們先前證明變形鏈球菌atlA基因從至少三個啟動子轉(zhuǎn)錄，作為四基因操縱子的一部分。在atlA區(qū)域的進(jìn)一步表征中，我們鑒定了一個基因，位于atlA起始密碼子上游249 bp，此處顯示能夠與atlA共轉(zhuǎn)錄。這一發(fā)現(xiàn)表明SMu0629基因和atlA的基因產(chǎn)物之間可能存在功能聯(lián)系。
圖1. 變形鏈球菌SMu0629基因座的轉(zhuǎn)錄分析。（A）atlA區(qū)域示意圖及RT-PCR分析。示意圖上方的基因命名與編號基于變形鏈球菌UA159的基因組序列信息。箭頭指示轉(zhuǎn)錄方向，箭頭內(nèi)部及開放閱讀框之間的數(shù)字分別表示開放閱讀框和基因間區(qū)的堿基對長度。使用反向引物（630-antisense）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，采用629-sense和630-antisense引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物退火位點(diǎn)如圖示。PCR產(chǎn)物在Tris-乙酸-EDTA凝膠中的電泳結(jié)果如下：M泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)；1泳道為RT-PCR產(chǎn)物；2泳道為未加逆轉(zhuǎn)錄酶的陰性對照；3泳道為UA159染色體DNA的PCR陽性對照。（B）由165個氨基酸組成的SMu0629蛋白序列。該序列含八個可能形成金屬結(jié)合位點(diǎn)的保守半胱氨酸（加粗顯示），以及硫氧還蛋白超家族多個成員活性位點(diǎn)特有的FX4CXXC基序（序列上方標(biāo)注；第48至56位氨基酸）。
SMu0629基因長495 bp，編碼一個保守的假設(shè)蛋白，預(yù)測分子量為19,504 Da。Pfam搜索顯示，殘基51至155將SMu0629置于一個未表征的UPF0153蛋白家族中，該家族包含八個保守的半胱氨酸，被提出形成金屬結(jié)合位點(diǎn)。值得注意的是，SMu0629還包含一個F-X4-C-X-X-C基序。C-X-X-C基序已知是硫醇-二硫鍵氧化還原酶家族成員的活性位點(diǎn)，這些酶參與多種氧化還原活性，包括蛋白質(zhì)還原和氧化應(yīng)激耐受。鑒于AtlA在生物膜形成中的重要作用以及atlA和SMu0629基因產(chǎn)物之間可能存在功能聯(lián)系，我們探討了氧氣對各種變形鏈球菌菌株生長和生物膜形成的影響。
圖2. 變異鏈球菌菌株（野生型與630NP）的生長情況。(A) 在BHI肉湯中的需氧生長通過Bioscreen C系統(tǒng)監(jiān)測，該系統(tǒng)設(shè)置為每30分鐘振蕩15秒（需氧條件）。對于厭氧生長，在肉湯培養(yǎng)物表面覆蓋無菌礦物油（覆油條件）。(B) 變異鏈球菌UA159和630NP在添加蔗糖的BM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時形成的生物膜。需氧培養(yǎng)在搖床（150 rpm）中進(jìn)行，厭氧培養(yǎng)則覆蓋礦物油。詳見正文。數(shù)據(jù)代表至少兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)（三次或以上重復(fù)）的結(jié)果。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）。
氧氣對自溶和生物膜形成的影響。 為了比較變形鏈球菌在氧氣存在和不存在下的生長，在好氧和厭氧條件下在BHI培養(yǎng)基中監(jiān)測生長，如材料與方法中詳細(xì)描述。如圖2A所示，野生型和AtlA缺陷菌株的生長速率沒有觀察到差異。然而，在厭氧條件下，atlA突變體在穩(wěn)定期晚期顯示出對自溶的顯著抗性。光學(xué)顯微鏡觀察顯示，當(dāng)突變體在好氧條件下生長時，未觀察到atlA缺陷菌株特征性的長鏈形成。
對于體外生物膜測定，微孔板在空氣中在旋轉(zhuǎn)搖床上在好氧和厭氧條件下生長。有趣的是，當(dāng)UA159在通氣條件下生長48小時時，在補(bǔ)充蔗糖的BM培養(yǎng)基中形成生物膜的能力顯著受損。此外，在相同條件下，atlA突變體比野生型菌株積累了更多的生物膜生物量。當(dāng)變形鏈球菌用蔗糖培養(yǎng)時，Gtf酶產(chǎn)生大量水不溶性葡聚糖，促進(jìn)生物膜的粘附和積累。在補(bǔ)充葡萄糖的BM培養(yǎng)基中的生物膜形成無法研究，因?yàn)樵谶@些條件下630NP形成生物膜的能力非常差。氧氣對生物膜形成的影響以及通過atlA突變在空氣中恢復(fù)生物膜形成表明細(xì)胞自溶可能受氧氣影響，導(dǎo)致變形鏈球菌形成生物膜的能力變化。我們推斷與氧氣中生長相關(guān)的這些表型可能與SMu0629作為潛在氧化還原酶的功能有關(guān)。因此，我們表征了缺乏SMu0629基因的菌株的AtlA生物發(fā)生和生長特性。
SMu0629基因突變體的構(gòu)建和表征。 通過缺失和插入非極性或極性卡那霉素盒破壞SMu0629基因，創(chuàng)建菌株629NP和629P。通過實(shí)時RT-PCR確認(rèn)SMu0629基因中的非極性插入允許高效通讀到atlA。從菌株629P的總RNA測量從atlA緊鄰上游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的atlA mRNA，而不是作為與SMu0629基因共轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。如圖3A所示，629P中的atlA mRNA比629NP或野生型少約50%，證實(shí)了基因可以共轉(zhuǎn)錄，并為SMu0629和AtlA之間可能的功能聯(lián)系提供了證據(jù)。
在BHI培養(yǎng)基中這些菌株的生長速率沒有觀察到明顯差異。還值得注意的是，在629NP或629P突變體中未觀察到atlA缺陷突變體特征性的聚集和鏈長增加。有趣的是，SMu0629基因突變體在補(bǔ)充葡萄糖的BM培養(yǎng)基中顯示出生物膜形成的顯著增加，與野生型菌株相比，24小時后增加25%，48小時后增加55%。然而，在BM-蔗糖中未觀察到生物膜形成的明顯差異。
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