變形鏈球菌的atlA基因編碼一種自溶素，這種自溶素是生物膜成熟和正常細(xì)胞表面生物發(fā)生所必需的。我們發(fā)現(xiàn)，這種主要導(dǎo)致齲齒的病原體形成生物膜的能力在通氣環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)顯著受損，并且暴露于氧氣的細(xì)胞顯示出表面蛋白譜的顯著變化。atlA基因的失活緩解了氧氣存在下生物膜形成的抑制。此外，AtlA缺陷菌株特征性的長(zhǎng)鏈形成在通氣生長(zhǎng)的細(xì)胞中不太明顯。SMu0629基因緊鄰atlA上游，編碼一種含有C-X-X-C基序的產(chǎn)物，這是硫醇-二硫鍵氧化還原酶的典型特征。SMu0629的失活顯著降低了AtlA蛋白水平并導(dǎo)致對(duì)自溶的抗性。SMu0629突變體在氧氣存在下也顯示出比親本菌株更強(qiáng)的生物膜形成能力。SMu0629的表達(dá)被證明受VicRK雙組分系統(tǒng)控制，后者影響變形鏈球菌的氧化應(yīng)激耐受性。vicK的破壞也抑制了AtlA的加工，并且突變體對(duì)自溶高度抗性。在好氧條件下生長(zhǎng)時(shí)，vicK突變體也比UA159菌株顯示出顯著增加的生物膜形成。本研究闡明了AtlA和VicK在協(xié)調(diào)表面生長(zhǎng)和包膜生物發(fā)生以響應(yīng)氧化還原條件中的核心作用。
變形鏈球菌被認(rèn)為是人類齲齒的主要病原體。變形鏈球菌的一個(gè)關(guān)鍵毒力特性是它能夠在牙齒表面建立結(jié)構(gòu)和組成復(fù)雜的生物膜的一部分。一旦在某個(gè)位置建立，口腔生物膜隨時(shí)間保持相對(duì)穩(wěn)定，盡管環(huán)境條件不斷變化。在這些環(huán)境挑戰(zhàn)中生存并成為穩(wěn)定口腔生物膜群落中數(shù)量顯著的成員是變形鏈球菌持久性和致齲性的基本要素。最近，我們鑒定了一種表面相關(guān)蛋白（SMu0630），該蛋白是變形鏈球菌UA159正常生物膜形成所必需的。在后續(xù)研究中，該蛋白被揭示為生物膜成熟和細(xì)胞自溶所必需的。該基因產(chǎn)物因其自溶活性被命名為AtlA。AtlA是正常細(xì)胞表面生物發(fā)生所必需的，因?yàn)锳tlA缺陷菌株具有顯著減少的可用非離子去污劑提取的表面蛋白補(bǔ)體。此外，AtlA被證明是變形鏈球菌完全表達(dá)遺傳能力所必需的。
細(xì)菌自溶素能夠水解細(xì)胞壁的肽聚糖組分，這是一種高度動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)而擴(kuò)展，并在細(xì)胞分裂或分化時(shí)重塑。自溶素通常在整個(gè)生長(zhǎng)周期中產(chǎn)生，并已被證明在許多關(guān)鍵功能中發(fā)揮核心作用，包括細(xì)胞壁更新、細(xì)胞生長(zhǎng)、抗生素抗性、細(xì)胞表面粘附、遺傳能力、蛋白質(zhì)分泌和致病性。自溶素活性的調(diào)節(jié)被認(rèn)為最常見(jiàn)于翻譯后水平，通過(guò)底物構(gòu)象或修飾、通過(guò)各種細(xì)胞壁結(jié)合域與細(xì)胞的差異結(jié)合、細(xì)胞壁中酶復(fù)合物的拓?fù)渑帕幸约拜敵鑫稽c(diǎn)的控制，盡管自溶素的轉(zhuǎn)錄控制已被證明。在一些革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期晚期時(shí)，自溶自發(fā)發(fā)生。這一致命事件被提出為有意義的生物學(xué)現(xiàn)象，因?yàn)榧?xì)胞裂解釋放的DNA有助于自然感受態(tài)細(xì)菌的生存和遺傳多樣性。由β-內(nèi)酰胺抗生素引起的不可逆效應(yīng)，如青霉素誘導(dǎo)的細(xì)菌溶解，也得到了很好的描述。顯示影響自溶素活性或激活的其他因素包括營(yíng)養(yǎng)限制、質(zhì)子動(dòng)勢(shì)力以及許多影響細(xì)胞壁物理化學(xué)性質(zhì)的因素。
影響牙齒生物膜組成和活性的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)境因素是氧氣。在人類口腔中，氧氣豐富，但定植于口腔各種表面的生物膜支持多種需氧菌、兼性厭氧菌和專性厭氧細(xì)菌。在清潔釉質(zhì)表面發(fā)展口腔生物膜期間，牙菌斑的氧化還原電位下降，牙菌斑的深層被認(rèn)為是厭氧的。因此，口腔生物膜的氧張力和氧化環(huán)境隨部位和生物膜特性變化很大。毫不奇怪，口腔細(xì)菌生物膜具有相對(duì)活躍的氧代謝，并已發(fā)展出防御氧氣存在或各種氧化還原環(huán)境的能力。
在當(dāng)前研究中，我們證明了氧氣對(duì)變形鏈球菌形成生物膜的能力具有深遠(yuǎn)影響，并證明氧氣影響AtlA的表達(dá)和成熟，而AtlA對(duì)生物膜形成和正常細(xì)胞表面生物發(fā)生至關(guān)重要。揭示了氧化環(huán)境、AtlA生物發(fā)生、細(xì)胞自溶、雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和變形鏈球菌毒力表達(dá)之間聯(lián)系的新見(jiàn)解。
材料與方法
細(xì)菌菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件。 大腸桿菌DH10B在Luria肉湯中生長(zhǎng)，變形鏈球菌UA159及其衍生物在腦心浸液肉湯中生長(zhǎng)。遺傳轉(zhuǎn)化后選擇抗生素抗性菌落時(shí)，根據(jù)需要向培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素、紅霉素和卡那霉素。對(duì)于生物膜形成測(cè)定，變形鏈球菌菌株在補(bǔ)充有葡萄糖或蔗糖（終濃度20 mM）的半限定培養(yǎng)基BM中的微孔板中生長(zhǎng)?；蚓幪?hào)對(duì)應(yīng)于Los Alamos口腔病原體網(wǎng)站注釋的編號(hào)。
突變菌株的構(gòu)建。 用于缺失誘變的引物如表1所示。為了在SMu0629、vicR和vicK基因中產(chǎn)生缺失，從變形鏈球菌UA159的染色體DNA中擴(kuò)增每個(gè)基因的5'和3'側(cè)翼區(qū)域，使用設(shè)計(jì)到每個(gè)引物組中的BamHI位點(diǎn)連接在一起，并克隆到pGEM-T Easy載體中。質(zhì)粒用BamHI消化，并與來(lái)自pALH124或pVT924的非極性或極性卡那霉素盒連接，用相同酶消化。誘變質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化變形鏈球菌UA159。轉(zhuǎn)化體在含有卡那霉素的BHI瓊脂上選擇，并通過(guò)PCR和測(cè)序確認(rèn)每個(gè)基因中的雙交換重組。本研究中構(gòu)建的變形鏈球菌突變株列于表2。
生長(zhǎng)、生物膜和自溶測(cè)定。 為了比較生長(zhǎng)速率，用變形鏈球菌過(guò)夜培養(yǎng)物的1:100稀釋液接種新鮮培養(yǎng)基。在37°C常規(guī)時(shí)間間隔測(cè)量600 nm的光密度或使用Bioscreen C實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)監(jiān)測(cè)。Bioscreen C系統(tǒng)設(shè)置為每30分鐘搖動(dòng)15秒。對(duì)于厭氧條件，將無(wú)菌礦物油覆蓋在培養(yǎng)物上。還通過(guò)相差顯微鏡觀察培養(yǎng)物以記錄鏈長(zhǎng)，如先前詳細(xì)描述。在微孔板中形成穩(wěn)定生物膜的能力如先前描述測(cè)量。通過(guò)將板在空氣中、含5% CO2的好氧氣氛中靜態(tài)孵育，或在好氧氣氛中以150 rpm在旋轉(zhuǎn)搖床上振蕩，有或無(wú)礦物油覆蓋，允許生物膜形成。自溶測(cè)定如先前描述進(jìn)行，略有修改。簡(jiǎn)要地，在生長(zhǎng)指數(shù)期晚期的變形鏈球菌細(xì)胞收獲，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌兩次。將細(xì)胞重懸于含有1 M KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2和0.4%疊氮化鈉的20 mM磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）中，至OD550為0.9。細(xì)胞懸浮液在44°C孵育，并使用Bioscreen C實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞懸浮液的OD550來(lái)自溶。
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